Herstellung und Charakterisierung von zellpermeablem Interferon-α des Waldmurmeltieres (Marmota monax) [Préparation et caractérisation de l'interféron α des cellules perméables de la marmotte américaine (Marmota monax). Preparation and characterization of interferon-α of the cell-permeable of Woodchucks (Marmota monax>/I>)].

Résumé

Interferon (IFN) spielt eine wichtige Rolle bei der Therapie von malignen Tumoren, entzündlichen Erkrankungen und Infektionen. So ist IFN z.B. Teil der Therapie der chronischen Hepatitis B. Bei weltweit 350 Millionen Infizierten und einer Million Todesfällen pro Jahr stellt die Hepatitis B ein ernstes medizinisches Problem dar. Bis zu 40% der mit IFN- α behandelten Patienten zeigen eine klinische Verbesserung im Sinne einer Normalisierung der Serum-Transaminasen und Beendigung der Virusreplikation. Die IFN-Therapie ist aber nicht unproblematisch: Nebenwirkungen sind häufig und können stark und dosislimitierend sein. Dies und die Tatsache, dass IFN bis heute ausschließlich parenteral verfügbar ist, wirkt sich negativ auf die Compliance der Patienten aus. Ziel der Arbeit war zu untersuchen, ob durch die Fusion des IFN-α Moleküls mit dem Zellpermeabilität vermittelnden Translokationsmotiv (TLM)-Peptid aus der PreS2-Region des HBV ein zellpermeables Fusionsprotein (TLM-IFN) generiert werden kann. Weiter sollte untersucht werden, ob TLM-IFN bei oraler Verabreichung verfügbar und antiviral wirksam ist. Zur rekombinanten Herstellung von TLM-IFN und des entsprechenden Kontrollproteins (Kontroll-IFN) wurden zunächst bakterielle Expressionsplasmide hergestellt, die für TLM- IFN (pAS2) bzw. Kontroll-IFN (pAS3) kodieren. Escherichia coli wurden mit pAS2 bzw. pAS3 transformiert und anschließend induziert. Sowohl TLM-IFN als auch Kontroll-IFN wurden mittels Ni-NTA-Affinitätschromatographie isoliert und angereichert. Die Funktionalität von TLM-IFN und Kontroll-IFN wurde durch Untersuchung der Induktion der Expression des Myxovirus-Resistance-A (MxA)- und des 2 ́-5 ́Oligoadenylatsynthetase (25OAS)-Gens in vitro nachgewiesen. Die Untersuchung der Zellpermeabilität in vitro hat gezeigt, dass TLM-IFN im Gegensatz zu Kontroll-IFN zellpermeabel ist. Das Pilotexperiment in Mäusen, die mit Adenovirus, das das 1,2fache HBV-Genom enthält, infiziert worden waren, hat gezeigt, dass oral verabreichtes TLM-IFN in vivo verfügbar ist und stärkere antivirale Aktivität besitzt als Kontroll-IFN. Durch die TLM-Modifikation könnte eine orale IFN-Therapie möglich werden. Um eindeutig zeigen zu können, dass die erhöhte Zellpermeabilität für die stärkere antivirale Aktivität von TLM-IFN in vivo ursächlich ist, müssen Versuche im Marmota monax-Modell durchgeführt werden. Durch die Fusion mit dem TLM könnten auch andere in der Medizin eingesetzte Proteine zellpermeabel und oral verfügbar gemacht werden.